10. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PEROXIDASA (Prueba de Storchs)

Fundamento

La actividad de la enzima peroxidasa en la leche se utiliza para el control de la pasteurización. La enzima peroxidasa se mantiene activa tras el proceso de pasteurización baja (LTLT) de la leche, poniéndose en evidencia su actividad por la aparición de un color azul tras la reacción. Sin embargo, cuando el método de pasteurización aplicado a la leche es de mayor temperatura (pasteurización alta, HTST) se destruye la enzima, no apareciendo color en los 30 segundos siguientes al desarrollo de la reacción.

El método es cualitativo y se basa en poner en evidencia la presencia de la enzima mediante el desarrollo de una reacción colorimétrica. La enzima peroxidasa presente en la leche descompone el peróxido de hidrógeno. El oxígeno atómico liberado oxida la 1,4 difenildiamina, incolora, que se convierte en indofenol púrpura, dando una coloración azulada que es proporcional a la concentración de la enzima en la leche.

Materiales

· Tubos de ensayo.

· Pipetas de 5 y 2 mL.

Reactivos

· Solución de 1,4 fenilendiamina: disolver 2 g de fenilendiamina (C6H8N2) en agua caliente a 50°C y diluir hasta 100 mL Conservar la solución en un frasco de color marrón oscuro con tapón de vidrio y almacenar en un lugar fresco y al abrigo de la luz. Unos o dos días después de la preparación, la solución de 1,4 difenilenamina forma sedimento, por lo que es necesario desecharla.

· Solución de peróxido de hidrógeno: diluir 9 mL de peróxido de hidrógeno al 30% en agua hasta 100 mL Añadir 1 mL de ácido sulfúrico concentrado por litro de solución, como estabilizador. Esta solución permanece estable durante un mes si se conserva en un lugar fresco y al abrigo de la luz, en un frasco con tapón de vidrio que impida el contacto con compuestos orgánicos.

Procedimiento

· Introducir 5 mL de leche en un tubo de ensayo.

· Añadir 5 mL de la solución de 1,4 fenilendiamina.

· Añadir dos gotas de la solución de peróxido de hidrógeno.

· Observar la coloración dentro de los 30 segundos siguientes.

Interpretación

· Si aparece color azul en los 30 segundos siguientes a la mezcla de los reactivos, la reacción es positiva existiendo actividad peroxidasa en la leche ensayada.

· Si no aparece color la reacción es negativa, lo que nos indicaría que la peroxidasa ha sido inactivada por el calentamiento.

· Si el color azul aparece más de 30 segundos después de la adición de los reactivos a la leche, la reacción no es específica.